多孔磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶性状及对成骨细胞生物学行为的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.012

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (30): 4831-4837.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.012

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多孔磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶性状及对成骨细胞生物学行为的影响

董静静¹，毕龙²，李娜³，郭誉¹，徐强¹，雷伟²，崔赓⁴

1解放军空军临潼航空医学鉴定训练中心，陕西省西安市 710600
2解放军第四军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032
3解放军兰州军区临潼疗养院疗一科，陕西省西安市 710600
4解放军301医院骨科，北京市 100039

修回日期:2014-06-15 出版日期:2014-07-16 发布日期:2014-08-08
通讯作者: 崔赓，副主任医师，解放军301医院骨科，北京市 100039
作者简介:董静静，女，1984年生，陕西省渭南市人，汉族，主治医师，2013年解放军第四军医大学西京医院骨科毕业，博士，主要从事骨科填充材料的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金项目(81000790)；北京市新星项目：2010年度北京市科技新星计划-崔赓(2010-77)

Mechanical and biological properties of porous calcium phosphate cement/fibrin glue for bone regeneration in vitro

Dong Jing-jing¹, Bi Long², Li Na³, Guo Yu¹, Xu Qiang¹, Lei Wei², Cui Geng⁴

1Lintong Aeromedical Evaluation and Training Center of Chinese Air Force, Xi’an 710600, Shaanxi Province, China
2Department of Orthopedics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
3Lintong Sanatorium of Lanzhou Military Command, Xi’an 710600, Shaanxi Province, China
4Department of Orthopedics, the 301 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, Chin

Revised:2014-06-15 Online:2014-07-16 Published:2014-08-08
Contact: Cui Geng, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the 301 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, China
About author:Dong Jing-jing, M.D., Attending physician, Lintong Aeromedical Evaluation and Training Center of Chinese Air Force, Xi’an 710600, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81000790; Scientific New Star Plan of Beijing City, No. 2010-77

摘要/Abstract

摘要：

背景：在多孔材料磷酸钙骨水泥粉末中复合纤维蛋白胶是否能有效改善磷酸钙骨水泥的生物力学性能，同时加速其在体内的降解代谢，促进体内骨再生，目前还未被证实。
目的：构建不同配比的多孔磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，探索其诱导成骨的生物学特性。
方法：将磷酸钙骨水泥与纤维蛋白胶分别以1∶1、3∶1、5∶1(mL/g)的配比复合，以单纯的磷酸钙骨水泥为对照，检测各组材料的初凝和终凝时间、压缩强度与弹性模量，扫描电镜观察材料表面结构。将第3代成骨细胞分别接种于4组材料表面，以单纯培养细胞为空白对照，观察不同时间点细胞黏附、增殖及碱性磷酸酶活性。
结果与结论：1∶1、3∶1复合材料组初凝时间和终凝时间长于对照组(P < 0.05)，5∶1组复合材料组初凝时间和终凝时间短于对照组(P < 0.05)。磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料表面较单纯的磷酸钙骨水泥致密而光滑，孔径随着纤维蛋白胶浓度的增加而降低。3∶1、5∶1复合材料组压缩强度高于对照组(P < 0.05)，1∶1、3∶1、5∶1复合材料组弹性模量高于对照组(P < 0.05)。4组材料上的细胞黏附、增殖及碱性磷酸酶活性差异无显著性意义，但均高于空白对照组(P < 0.05)。表明纤维蛋白胶的加入克服了磷酸钙骨水泥脆性较高的缺点，同时也保留了其促进成骨的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 磷酸钙骨水泥, 生物蛋白胶, 骨缺损, 生物力学, 成骨细胞, 增殖, 碱性磷酸酶, 骨再生, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Fibrin glue introduced into calcium phosphate cement has not been confirmed whether this way could overcome the compressive limits and the low degradation of calcium phosphate cement and to modify the biological properties of calcium phosphate cement.
OBJECTIVE: To explore the mechanical and biological properties of calcium phosphate cement/fibrin glue at different powder/liquid ratio for bone regeneration in vitro.
METHODS: Calcium phosphate cement and fibrin glue were mixed at ratios of 1:1, 3:1, 5:1 (mL/g), and the pure calcium phosphate cement served as controls. Setting time, scanning electron microscope and the biomechanical test were used to analyze the composite scaffold structure, physical performance and the mechanical properties. Passage 3 osteoblasts were respectively inoculated on the material surface of the four groups, and pure cells served as blank controls. Cell adhesion, proliferation and alkaline phosphatase activity were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The initial and final setting time of calcium phosphate cement/fibrin glue at 1:1 and 3:1 (mL/g) was higher than that in the control group (P < 0.05), while the initial and final setting time of calcium phosphate cement/fibrin glue at 5:1 (mL/g) was lower than that of the control group (P < 0.05). Scanning electron microscope showed smoother and denser surface of composite scaffolds compared with the pure calcium phosphate cement. The aperture of the composite scaffolds was decreased with the increasing concentration of fibrin glue. The compressive strength of composite scaffolds at 3:1 and 5:1 was higher than that of the control group (P < 0.05), while the modulus of the composite scaffolds at 1:1, 3:1, 5:1 was higher than that of the control group (P < 0.05). Cell adhesion, proliferation and alkaline phosphatase activity showed no difference among the three composite scaffold and control groups, but all higher than the blank control group (P < 0.05). These findings indicate that fibrin glue introduced into calcium phosphate cement can overcome the low-strength limits of calcium phosphate cement, and maintain the good biological properties of calcium phosphate cement for bone regeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: calcium phosphates, osteoblasts, fibrin tissue adhesive

中图分类号:

R318

董静静，毕龙，李娜，郭誉，徐强，雷伟，崔赓 . 多孔磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶性状及对成骨细胞生物学行为的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4831-4837.

Dong Jing-jing, Bi Long, Li Na, Guo Yu, Xu Qiang, Lei Wei, Cui Geng . Mechanical and biological properties of porous calcium phosphate cement/fibrin glue for bone regeneration in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4831-4837.

图/表（结果） 3

2.1 初始凝固时间和终末凝固时间的测定 磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶配比浓度为1∶1和3∶1时，初凝时间较单纯磷酸钙明显延长，且1∶1配比初凝时间更长，达到(20.41±1.21) min (P < 0.05)；磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶配比浓度为5∶1时，初凝时间则较单纯磷酸钙缩短(P < 0.05)；终凝时间也表现出相同的特点，1∶1配比组终凝时间最长，5∶1配比组最短；3组不同配比浓度的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料与单纯磷酸钙初凝时间和终凝时间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2 扫描电镜观察结果 任意配比浓度的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶和单纯磷酸钙骨水泥的表面结构存在明显差异，磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶的表面相对磷酸钙骨水泥更平滑，且随着纤维蛋白胶含量的升高，表面更平滑，所以1∶1配比组材料表面最平滑，孔径最小，材料颗粒最细小；单纯磷酸钙骨水泥材料表面最粗糙，颗粒直径相差较大，有较大的孔洞结构(图2)。

2.3 体外生物力学检测结果 图3为各组材料在室温条件下充分干燥后测得的体外压缩强度和弹性模量。与单纯磷酸钙骨水泥比较，3∶1和5∶1配比组的压缩强度均显著提高(P < 0.05)，1∶1配比组无显著变化，而任意配比浓度的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶弹性模量较磷酸钙骨水泥有明显提高(P < 0.05)，且5∶1配比组最高。

2.4 不同配比复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶对成骨细胞黏附的影响 如图4所示，成骨细胞在不同配比的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶材料及单纯的磷酸钙骨水泥上培养黏附1 h和2 h后，其吸光度值明显高于空白对照组(P < 0.05)，且所有组2 h较1 h的细胞黏附吸光度值高(P < 0.05)，但不同配比磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶组和单纯的磷酸钙骨水泥在1 h和2 h时，成骨细胞附着的吸光度差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 不同配比复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶对成骨细胞增殖的影响 如图5所示，成骨细胞在各组材料上分别培养1，3，7 d后，其细胞增殖的吸光度均明显高于空白对照组(P < 0.05)，但不同配比的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶组和单纯磷酸钙骨水泥组在1，3，7 d时的细胞增殖吸光度差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 不同配比复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶对成骨细胞碱性磷酸酶表达的影响 如图6所示，成骨细胞在各组材料上分别培养3，7 d后碱性磷酸酶的表达均明显高于空白对照组(P < 0.05)，但不同配比的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶组和单纯磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶的表达差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

大段骨缺损的修复和重建一直是困扰骨科临床医生的难题，虽然自体骨被认为是骨缺损修复填充的最佳材料，但是自体骨取材有限，从而极大地限制了其在临床的广泛应用。异体骨在很大程度上为骨缺损填充提供了较为丰富的来源，但是免疫排斥及交叉传染等多种潜在危险因素的存在也极大限制了异体骨在临床上的广泛应用。生物材料的出现，一方面解决了来源有限的问题，另一方面也解决了排斥和传染的问题，因此对人工植骨材料的研究已经成为骨科及材料学科研究的热点之一。

多孔磷酸钙骨水泥因其诸多的生物学优点，被越来越多的材料学家所关注和研究，其生物学特性主要表现在^[1-5]：与人体自身的骨矿物化学组成及结构相似；为可吸收型材料；具有良好的生物学活性；可促进细胞功能的表达；有良好的骨传导和骨诱导性能。不过，磷酸钙和天然的骨组织相比降解速度较慢，同时其自身的脆性显著限制了其在临床中的应用。所以，目前如果对磷酸钙骨水泥进行改良，提高其生物力学性能的同时也加快其降解吸收成为生物材料学界研究的热点。有学者在体外实验发现，磷酸钙对周围软组织细胞没有明显的毒害作用，同时还可以作为药物和因子的载体，具有良好的研究前景^[6]。Hesaraki等^[7]报道经乙酸和柠檬酸修饰处理的磷酸钙，体内自凝时间明显缩短，同时最大抗压也明显增强。以前的研究还发现，单独使用磷酸钙骨水泥在体内可引起早期的钙盐沉积、生物矿化及新骨形成；当多孔材料磷酸钙复合其他生物材料如胶原、纤维蛋白胶等可增强其成骨作用^[8-14]，不过很多学者对该现象提出了质疑^[8-9]。

生物蛋白胶是在人血或其他动物血中提取出来的一种天然存在的产物。目前临床及实验中广泛使用的生物蛋白胶，是通过人工提取的方式在人血或者哺乳动物血液中提取高浓度的纤维蛋白原，在此基础上加上相关的凝血酶、抑肽酶等，以及其他所需要的离子成分，如Ca²⁺等。生物蛋白胶可模拟体内凝血机制最后通路的最后一步，将纤维蛋白原水解为纤维蛋白单体，再聚合形成有一定三维空间结构的纤维蛋白。在临床上，被作为一种有效的止血制剂而广泛应用，因其符合生理凝血机制，同时又无毒无菌且可以被体内代谢吸收，具有止血、预防组织粘连、促进创伤愈合等功能。除此以外，因其在体内可被逐渐降解吸收，很多学者将其作为药物载体提供良好的缓释系统，为体内抗生素及抗肿瘤等需要逐步用药的治疗提供良好的基础^[15-21]。

在多孔材料磷酸钙粉末中复合胶状物质纤维蛋白胶是否能有效改善磷酸钙的生物力学性能，同时加速磷酸钙在体内的降解代谢，促进体内骨再生，目前还未被证实。因此，本实验拟通过构建不同配比的纳微米复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶，探索不同配比复合材料的生物学特性，继而通过细胞学等技术和方法，研究磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶诱导成骨的细胞学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：观察实验。

时间及地点：于2013年4月至2014年5月在解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所完成。

材料：

实验方法：

构建不同配比的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料：将微纳米化磷酸钙粉末和纤维蛋白胶按不同配比浓度1∶1、3∶1、5∶1(g/mL)混合制成不同形状的复合材料，单纯的磷酸钙骨水泥为对照组，共4组，所有材料均一次制备，尽可能减少误差。直径6 mm高10 mm的复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶用于扫描电镜观察和体外生物力学检测，直径10 mm高3 mm的复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶用于初凝时间和终凝时间的检测及细胞学研究。

初始凝固时间和终末凝固时间的测定：采用Gillmore法检测，将材料按4种比例混合后填入磨具，每组5个标本(n=5)，在室温下用Gillmore针轻刮材料表面，每5 s一次，将以0.3 MPa静态压力搔刮表面不能引起可见划痕的时间定义为初始凝固时间，以5 MPa静态压力搔刮表面不能引起可见划痕的时间定义为终末凝固时间。

扫描电镜观察：4组材料成型后，每组5个标本(n=5)，室温下继续干燥24 h，表面喷金，用扫描电镜观察材料表面微观结构。

体外生物力学检测：选用日本岛津公司电子万能试验机(AGS-X系列)，实验依据ISO 5833国际标准，选用直径 6 mm高10 mm的标本进行生物力学测试，每组5个标本(n=5)。首先将制备的各组材料放置于空气中晾干，力学实验仪以0.01 mm/s的垂直加载速度对实验标本进行轴向压缩，测得各标本的压缩强度与弹性模量。

不同配比磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料对成骨细胞黏附的影响：

成骨细胞的分离培养：在超净细胞培养工作台上，取同胎新生的SD仔鼠头盖骨6个，经PBS漂洗后去除骨膜和其他软组织，将仔鼠的头盖骨剪成碎片，置于2 mL 0.25%的胰蛋白酶中消化1.5 h，整个消化过程在37 ℃孵箱完成，弃掉溶液上清。1%的Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰蛋白酶各 1 mL继续消化1 h，换液后再继续消化1 h。随后在离心机上800 r/min离心8 min，弃上清后加入DMEM液体8 mL，吹打均匀后接种在75 cm²无菌培养瓶中，继续加入含有体积分数10%新生牛血清的DMEM溶液8 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的孵育箱培养。每2 d换液1次。因为成纤维细胞比成骨细胞更容易贴壁，采用差数贴壁法即可得到纯化的成骨细胞并进行传代，实验取第3代细胞进行体外细胞实验。

实验分组：4组材料每组取18个放置于24孔培养板中，以不放任何试样的细胞培养板作为绝对空白对照组。取第3代成骨细胞，以1×10⁵/孔的密度接种于各24孔板内，再加入1 mL含有体积分数10%新生牛血清的DMEM溶液，放置于37 ℃恒温、体积分数5%CO₂、饱和湿度放的孵育箱培养，培养1，2 h后(每个时间点n=6)，弃掉培养液并用PBS漂洗2次，培养板中每孔加入200 μL 5 g/L的MTT和800 μL无新生牛血清无酚红的DMEM溶液，在37 ℃恒温、体积分数5%CO₂、饱和湿度孵育箱孵育4 h后，弃上清，每孔加入1 mL DMSO溶液使结晶体充分溶解后，每孔取200 μL转移到96孔培养板中，振荡10 min，在酶联免疫检测仪中，用490 nm波长测定溶液的吸光度A值，重复5次取平均值。

不同配比磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料对成骨细胞增殖的影响：每组18个标本，分别分3组放置在不同的24孔板里，以不放任何试样的细胞培养板作为完全空白对照组，每孔内接种2×10⁴生长状态良好的第3代成骨细胞，分别培养1，3，7 d后，MTT法检测细胞的增殖活性，其方法同细胞附着实验。

不同配比磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响：每组9个标本，分别放置于24孔板内，以不放任何材料的空白细胞培养板作为绝对空白对照组，接种生长状态良好的第3代成骨细胞2×10⁴/孔，分别培养3，7 d后做碱性磷酸酶活性检测，在490 nm波长下测吸光度A值，空白孔调零。

主要观察指标：不同配比多孔磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶的性状及对成骨细胞生物学行为的影响。

统计学分析：采用SPSS 18.0软件进行统计学处理及分析，采用单因素方差分析进行组间对比，两两比较用SNK-t 检验，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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磷酸钙骨水泥首次在1983年被Brown和Chow^[22]所报道，随后就一直被广大的材料学者所研究。本实验中各组材料的初凝时间和终凝时间虽然存在差异，但所有数据都可以满足临床需要。磷酸钙骨水泥因其脆性，0.02%的形变即可致其破裂。很多材料学者通过向磷酸钙骨水泥中加入不同的生物材料，如明胶、壳聚糖、胶原等，来提高其生物学性状及力学强度^[23-25]。在本实验中通过生物力学测试结果，不难发现，在磷酸钙骨水泥加入纤维蛋白胶，3种不同配比浓度都显著提高了磷酸钙骨水泥的压缩强度和弹性模量，从而很大程度提高和改善了磷酸钙骨水泥生物力学方面的不足，为进一步的临床应用提供了良好的实验学依据。单纯的磷酸钙骨水泥只是通过单纯的磷灰石结晶来构建三维立体结构提供抗压能力的。生物蛋白胶是由纤维蛋白原和凝血酶两部分组成，生物蛋白胶的作用是模拟体内凝血最后一步，即纤维蛋白原在凝血酶的分解下转化为纤维蛋白单体，随后通过聚合作用交联形成纤维蛋白，形成一定的交联三维结构^[26-29]。本实验中的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶，不仅有单纯磷灰石结晶构建的三维立体结构，同时生物蛋白胶的单体在聚合成三维网状结构时进一步加强了磷灰石结晶的作用，从而有效提高了磷酸钙骨水泥的力学强度。

成骨细胞在骨代谢过程中直接参与了材料表面与骨组织的结合过程，成骨细胞与材料的结合能力可从一定程度上反映体内自体骨与材料的结合能力，因此，本实验采用成骨细胞原代培养的方法，构建了骨与材料界面的体外模型，可通过研究成骨细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达的特点，间接反映材料在体内促进成骨的能力。成骨细胞在材料表面的附着是细胞在材料表面发挥功能的前提，细胞的黏附是细胞和材料相互作用过程中最早发生的，当成骨细胞在材料表面完成附着和铺展行为以后，经过一段时间的滞留期才会进入到增殖阶段，细胞的增殖状态对细胞功能表达非常重要。本实验中，相对比空白对照组，不同配比浓度的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶及单纯磷酸钙骨水泥在细胞黏附和细胞增殖方面均表现出明显的促进作用。可能因为各组材料在细胞培养液中释放出的Ca²⁺具有恰当的当量，与成骨细胞结合以后，可以通过激活成骨细胞上表达的钙敏感受体来激活三磷酸肌醇，同时也可以促进有丝分裂蛋白激酶信号传导通路，从而诱导更好的细胞增殖^[30]。本实验中，5∶1组和单纯磷酸钙骨水泥组在细胞黏附实验中较其他组的吸光值高(P < 0.05)。结合材料的电镜观察，推测是因为这两组材料的表面较粗糙，易于细胞伪足的伸展和攀爬，所以黏附数量较表面光滑组多。

很多材料学家研究还发现，纤维蛋白胶在体内代谢的过程可以产生血管内皮生长因子^[31]、成纤维细胞生长因子^[32]、转化生长因子β1^[33]、胰岛素样生长因子等^[34]。这些细胞因子，针对成纤维细胞或成骨细胞还是一种调理素，在纤维蛋白单体交联形成纤维蛋白凝块的过程中，以及与成纤维细胞的黏附中，可以帮助生物蛋白凝块附着在创伤部位，同时也可以协助成纤维细胞或者成骨细胞迁移^[35-46]。这也在某种程度解释了复合材料磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶保持着较好的生物学效能，可以促进体内的骨组织再生。由此可见，磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶及单纯磷酸钙骨水泥在体外具有类似的促进成骨作用，同时磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶具有良好的生物力学特性。将纤维蛋白胶引入磷酸钙骨水泥，有效克服了磷酸钙骨水泥脆性较高的缺点，同时也保留了其促进成骨的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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多孔磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶性状及对成骨细胞生物学行为的影响

Mechanical and biological properties of porous calcium phosphate cement/fibrin glue for bone regeneration in vitro

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